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如何選擇蛋白質純化的方法
點擊次數:1255 發布時間:2015-07-10
 


    生物化學和分子生物學上的差別,可以將二者區別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多,下面介紹幾種常用的測定方法。
如何選擇蛋白質純化的方法
    蛋白純化工作非常復雜,除了要保證純度外,蛋白產品還必須保持其生物學活性。純化工藝必須能夠每次都能產生相同數量和質量的蛋白,重復性良好。這就要求應用適應性非常強的方法而不是用能得到純蛋白的好方法去純化蛋白。隨著分子生物學的發展,越來越多的科研人員熟練掌握了分子生物學的各種試驗技術,并研制成套試劑盒,使基因克隆表達變得越來越容易。但分子生物學的上游工作往往并非是終目的,分子克隆與表達的關鍵是要拿到純的表達產物,以研究其生物學作用,或者大量生產出可用于疾病治療的生物制品。對蛋白純化的方法選擇及整體方案的制定提供一定的指導。

一、蛋白純化的一般原則

    蛋白純化要利用不同蛋白間內在的相似性與差異,利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染,而利用各蛋白質的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異,利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段二個階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如DNA、RNA等分開,由于此時樣本體積大、成分雜,要求所用的樹脂高容量、高流速,顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開,防止目的蛋白被降解。精細純化階段則需要更高的分辨率,此階段是要把目的蛋白與那些大小及理化性質接近的蛋白區分開來,要用更小的樹脂顆粒以提高分辨率,常用離子交換柱和疏水柱,應用時要綜合考慮樹脂的選擇性和柱效兩個因素。選擇性指樹脂與目的蛋白結合的特異性,柱效則是指各蛋白成分逐個從樹脂上集中洗脫的能力,洗脫峰越窄,柱效越好。僅有好的選擇性,洗脫峰太寬,蛋白照樣不能有效分離。

二、各種蛋白純化方法及其優、缺點

    1、 蛋白沉淀, 蛋白能溶于水是因為其表面有親水性氨基酸,在蛋白質的等電點處若溶液的離子強度特別高或者特別低,蛋白則傾向于從溶液中析出。硫酸銨是沉淀蛋白常用的鹽,因為它在冷的緩沖液中溶解性好,冷的緩沖液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸銨分餾常用作試驗室蛋白純化的步,它可以初步粗提蛋白質,去除非蛋白成分。蛋白質在硫酸銨沉淀中較穩定,可以短期在這種狀態下保存中間產物,當前蛋白質純化多采用這種辦法進行粗分離翻。在規;a上硫酸銨沉淀方法仍存在一些問題,硫酸銨對不銹鋼器具的腐蝕性很強。其他的鹽如硫酸鈉不存在這種問題,但其純化效果不如硫酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來,PEG是一種惰性物質,同硫酸銨一樣對蛋白有穩定效果,在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度,蛋白沉淀可通過離心或過濾獲得,蛋白可在這種狀態下長期保存而不損壞。蛋白沉淀對蛋白純化來說并不是多么好的方法,因為它只能達到幾倍的純化效果,而我們在達到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質的培養基及細胞裂解物中解脫出來。

    2、緩沖液的更換, 雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度,但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來,毫無疑問蛋白是處在高鹽環境中,需要想辦法脫鹽,可用的方法有利用半透膜透析,通過勤換透析液體去除鹽分,此法尚可,但需幾個小時,通常要隔夜,也難以用予大規模純化中。新型的設備將透析膜夾在兩個板中間,板的一側加緩沖液,另一側加需脫鹽的蛋白溶液,并在蛋白溶液一側通過泵加壓,可以使兩側溶液在數小時內達到平衡,若增加對蛋白溶液的壓力,還可迫使水分和鹽更多通過透析膜進入透析液達到對蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱,柱內的填料是小孔徑的顆粒,蛋白分子不能進入孔內,先于高濃度鹽離子從柱中流出,從而使二者分離。蛋白純化的每一步都會造成目的蛋白的丟失,緩沖液平衡的步驟尤甚。蛋白會結合在任何它能接觸的表面上,剪切力、起泡沫和離子強度的快速變化很容易讓蛋白失活。

 
 
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